Jan 18, 2024
Электроосажденная магнитная нанопористая мембрана для высокой
Том коммуникативной биологии
Биология связи, том 5, Номер статьи: 1358 (2022) Цитировать эту статью
1188 Доступов
1 Цитаты
4 Альтметрика
Подробности о метриках
Суперпарамагнитные наногранулы обладают рядом преимуществ перед микрогранулами для иммунозахвата наноносителей (внеклеточных везикул, липопротеинов и вирусов) в биоанализе: высокая эффективность захвата, сокращение времени инкубации и более высокая способность захвата. Однако наношарики трудно «опустить», поскольку их суперпарамагнитные свойства требуют высоких наномасштабных градиентов магнитного поля. Здесь показано, что электроосажденная трековая мембрана образует уникальное суперпарамагнитное нанокольцо с множеством краев вокруг нанопор. При однородном внешнем магнитном поле индуцированные монополь и диполь этого краевого наноперехода объединяются, создавая в 10 раз большую силу захвата наношариков. Плотную суспензию наногранул можно фильтровать через магнитную нанопористую мембрану (МНМ) с высокой пропускной способностью и степенью улавливания гранул 99%. Выход специфических наноносителей в гетерогенных средах наношариками/МНМ превышает 80%. Также продемонстрированы воспроизводимость, низкие потери и скорость захвата, не зависящая от концентрации. Таким образом, этот материал MNM расширяет возможности применения иммунозахвата наногранулами к физиологическим образцам.
Внеклеточные везикулы (ВВ) и липопротеины представляют собой биологические наночастицы, которые можно обнаружить в различных биологических жидкостях1,2,3. Недавно обнаруженная ими функция доставки молекулярного груза между клетками послужила катализатором значительной исследовательской деятельности во многих областях4,5. Эти биологические наноносители могут быть важными медиаторами межклеточной коммуникации6,7. Таким образом, специфические ЭВ, липопротеины и их молекулярные грузы также являются потенциальными биомаркерами заболеваний8,9,10. Однако эти биомаркеры часто не являются уникальными для больных клеток, а просто сверхэкспрессируются. Следовательно, требуется точная количественная оценка. Из-за их размера и гетерогенности высокопроизводительная изоляция специфических ЭВ и липопротеинов остается сложной задачей и может внести существенную погрешность в анализ биомаркеров11,12,13,14,15. ЭВ и липопротеины также имеют тенденцию разлагаться, агрегироваться или адсорбироваться во многих устройствах16,17. Таким образом, немедленная и кратковременная изоляция предпочтительнее, чем разделение с помощью проточной цитометрии и хроматографии, процессы предварительной обработки/разделения которых являются длительными и сложными. Таким образом, эффективный, быстрый и доступный метод выделения является обязательным условием для любого клинического применения, связанного с ЭВ и липопротеинами. Достижения в области высокопроизводительных технологий улавливания полезны во многих биомедицинских областях, в том числе для обнаружения патогенных вирусов или бактерий.
Наиболее специфичным методом выделения ЭВ и липопротеинов является иммунозахват; 18,19,20 однако традиционные технологии иммунозахвата, такие как иммунопреципитация (ИП) и иммуноаффинная хроматография, имеют проблемы с низким выходом из-за насыщения зонда и потери аналита. Если наноносители помечены флуоресцентно, те, которые захвачены магнитными микрогранулами, можно отсортировать и количественно оценить с помощью проточной цитометрии. Однако процесс маркировки и выделения занимает много времени и может потребовать более одного дня для достижения оптимального выхода, что приводит к значительной потере наноносителей. Их производительность также ограничена длительным временем инкубации (8–48 часов) из-за низкой подвижности микрошариков для реакции стыковки, ограниченной транспортом. Решением проблем урожайности и времени инкубации является использование наномагнитных шариков. Их большая площадь поверхности на объем обеспечивает больше мест связывания. Их меньший размер приводит к более высокой диффузии и более короткому времени инкубации (~30 мин). Гранулы также могут диффундировать через гетерогенный физиологический образец, захватывая определенные мишени наночастиц, подвижность которых снижена из-за комплексообразования или агрегации. Большая площадь поверхности в расчете на объем обеспечивает большее количество связывающих зондов в раз, равном отношению радиусов микрошариков/наношариков (~100) для той же массовой концентрации шариков. Такое увеличение числа зондов может привести к полному истощению всех целевых наноносителей, особенно если зонды антител имеют высокую аффинность, что обеспечивает на порядки более высокий выход связывания наноносителей.
4 ×) trapping is necessary to produce >90% yield. A magnetic film can produce a higher field penetration length than a magnetic bead due to its non-focusing (non-radial) geometry. Recently, Issadore and colleagues developed a magnetic layer-coated nanoporous membrane with improved capture yield, but multiple layers of membranes are still required for efficient bead capture22. Although the field is long-range, the field gradient is not for a planar magnetic film, except at corners. In our earlier work on electric fields at microchannels23 and nanopores24, we showed that a singular electric field with a high gradient occurs in the high-permittivity (water) side of a wedge corner of a channel or a pore if the wedge angle α of the higher permittivity phase exceeds π. This wedge singular field decays radially from the wedge tip with a power-law scaling of −(π/α) − 1 and hence also has a high-field gradient. The radial decay exponent is bound between −2 of a sphere and −3/2 of an infinitely long cylinder. This singular wedge mode is antisymmetric around the wedge and introduces a dipole in the high-permittivity phase. There is a more well-known "lightning rod" wedge singularity in near-field plasmonics25,26,27 that is symmetric around the wedge, with the singular field occurring on the low-permittivity side. It occurs when the high-permittivity side has a wedge angle that is less than π. It introduces a monopole on the low-permittivity side of the wedge. Herein, we extend this concept to magnetic fields to achieve high-yield capture of superparamagnetic beads with high throughput. We designed a multi-edge superparamagnetic NiFe nanoedge with a heterogeneous junction, whose edges sustain both a magnetic monopole and dipole around each nanopore of a nanoporous polymer membrane. This approach will significantly increase the capture yield of one membrane to 99% at a throughput of 5 mL/h for a single magnetic nanoporous membrane (MNM)./p>80% of HDL is recovered using the method, nearly doubling the recovery rate for commercial kits. We also demonstrated that MNM has a high and consistent yield and hence, can provide the necessary statistics for quantifying biomarkers carried by EVs and lipoproteins in heterogeneous physiological fluids (Fig. 1c)./p>99% of the beads were captured. The bead capture efficiency did not diminish even at a flow rate of 5 mL/h. This throughput is high enough for most extracellular vesicle immunocapture applications. Furthermore, only 13% of the beads were lost when the flow rate was increased to 10 mL/h. For membranes with 1-μm pore size, the bead capture efficiency was still >80% at 1 mL/h. In stark contrast, only 22% of beads were captured by the sputtered 450-nm membrane (Fig. 3e). For larger vesicles above 300 nm, electroplated MNM with 1μm pore size can be used at a lower flow rate or with a higher external magnetic field./p>80% of HDL was recovered using this approach. To confirm the specificity of the immunocapture and non-specific adsorption in our device, two negative controls were tested. If no antibodies were functionalized onto the nanobeads in the experiments, <10% of HDL was lost in the device, which was due to non-specific adsorption and experimental error. When antibodies (Abcam, ab139401, rabbit monoclonal to ApoB) against apolipoprotein B, the structural protein for low-density lipoproteins (LDL), were used instead of anti-ApoA-I, the loss increased to 14%. The additional 4% loss may come from the non-specific capture of HDL by anti-ApoB. In both negative controls, the non-specific capture rate of <15% is significantly lower than the specific capture rate of 80%. We benchmarked our method to a commercial immunocapture kit using their standard protocol (see Supplementary Note 5). As shown in Fig. 4c, for nanobeads, only 20% HDL was captured by the μColumn (Milyteni Biotec) because of the low bead capture efficiency of the packed column. Furthermore, for microbeads like Dynabeads™, even after 16 h of incubation, which is much longer than the standard protocol, the HDL capture efficiency does not exceed 50%. For the same incubation time of 1 h as the nanobeads, only 25% HDL was recovered (Supplementary Fig. S4), marginally >15% non-specific capture rate./p>80% of HDL particles recovered and minimal non-specific retention at less than 15%. The high and consistent yield of our system provides quantification potential for studies of EVs, lipoproteins, and other extracellular RNA carriers. We further demonstrated the performance of MNM in exosome capture, purification of HDL-enriched EV samples, and EGFR-positive EVs characterization. The direct lysis protocol in this study is applicable to a variety of downstream analyses for biomarker discovery and diagnostics, such as qRT-PCR, MS-based proteomics, sequencing, etc. For drug delivery, tissue engineering, and other applications requiring intact EVs as carriers, an EV-releasing protocol is necessary. Dissociation buffers36,37, photo-cleavable linker38, and protease-sensitive linkers39 are potential strategies to detach the EVs from the MNM. Our platform is also applicable for other molecular or virus immunocapture applications where capture efficiency and throughput are essential. In addition to the isolation of specific EVs from plasma for liquid biopsy applications (disease screening and therapy management), the MNM technology should also be useful for biomarker discovery from cell cultures, as we have demonstrated here for the DiFi sample, and also for organ-on-the-chip or organoid models35,40,41,42./p>4 buffer changes and concentrated with 3000 Da m.w. cutoff filters (Millipore). Total protein levels were determined for each lipoprotein sample (HDL and LDL) by BCA colorimetric assays (Pierce, ThermoFisher)./p>
Русский
English
Français
Deutsch
Español
Italiano
Português
日本語
한국어
Дом